无细胞蛋白表达与纯化服务

无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统。无细胞蛋白质合成体系是以外源目的mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中通过人工添加蛋白质合成所需的底物和能量，合成目的蛋白质的体外蛋白合成系统。无细胞蛋白表达系统模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程，它需要包含蛋白质合成过程中所必需的各种原料、能量、转录因子和翻译因子等。

该系统尤其适于膜蛋白和毒性蛋白的表达，同时具有周期短、通量高的特点。

该系统已有10多年历史，但是技术难度较大。目前全球范围内，无细胞表达主要以Rothe、Promega等公司提供的试剂盒表达方案为主，条件单一，价格昂贵。华美生物是国内第一批掌握大肠杆菌无细胞表达体系全套核心技术的公司，所有试剂均自配，核心组分均自产，反应体系含40余种成分，均可自由调整优化。自2015年建立该平台以来，已成功制备400多种蛋白，其中包含300多种传统大肠杆菌表达系统难以表达的1-15次跨膜蛋白和毒性蛋白，其中含有分子量高达130kDa-140kDa的多次跨膜蛋白。

系统优势服务优势我们承诺特色技术平台服务内容案例展示

系统优势

不受细胞结构限制，可以表达对宿主细胞有毒的外源蛋白质；
高通量，可以在多孔板上在各种不同条件下同时表达几种不同的蛋白，适用于高通量蛋白质组学研究；
开放式反应系统使反应条件易于更改，有助于调节基因转录、蛋白质合成和后翻译修饰；
允许添加非天然氨基酸或同位素标记的氨基酸来合成特殊用途的蛋白质；
步骤少，实验过程简单，对设备依赖性较低。

服务优势

超高性价比，低至5500元起；
货期短，20-25个工作日内即可交付；
产量高，部分蛋白可以达到5mg/mL。

我们承诺

无风险定制，不成功不收费

注：该无风险定制蛋白服务仅适用于800个氨基酸以内的蛋白质。如果您需要表达超过800个氨基酸的蛋白质，我们将按步骤收费。

特色技术平台

去垢剂技术平台

去污剂是同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双极性分子，能够使脂膜解体释放膜蛋白，并在溶液中为去膜状态下的膜蛋白提供疏水环境，维持膜蛋白的疏水跨膜结构。

华美生物搭建了基于无细胞表达的去垢剂技术平台。通过体外添加DNA模板、ATP、氨基酸、各种底物、细胞抽提物的酶等合成蛋白质，筛选不同去垢剂来提取目的蛋白，可很好溶解纯化跨膜蛋白，帮助其在溶液中形成天然正确构象。

Nanodisc技术平台

在含有去垢剂的缓冲液中，大部分膜蛋白可以维持稳定性和活性。但少数对去垢剂敏感的膜蛋白是不适宜含有去垢剂的缓冲条件的，具体表现为无法纯化，稳定性不好和没有活性。

华美生物搭建了基于无细胞表达的Nanodisc技术平台。通过体外添加MSP，磷脂分子使其在反应过程中边表达边组装成Nanodisc结构，保持其生物学活性并有很好的水溶性。

服务内容

步骤	服务项目	服务说明		华美生物特色	周期
1	质粒构建及制备	密码子优化、全基因合成		多载体优化为了得到最高的表达量并且最低的序列修饰，除常规N端融合表达蛋白外，我们还提供N端短肽优化表达服务。N端短肽包含6-11个氨基酸，可提高mRNA翻译效率，从而提高蛋白产量。	5-10工作日
		PCR扩增产物通过酶切连接到pET系列载体上
		重组质粒大量制备
2	小试表达及优化	多载体多反应条件优化，SDS-PAGE电泳检测，以确定最优反应条件		多条件表达方案无细胞表达能在多孔板上按照多种不同的条件，多种不同的蛋白同时平行进行。我们提供多条件优化表达服务。	7-10工作日（多条件纯化方案周期另加 3-5个工作日）
3	目标蛋白表达及纯化	根据小量结果提供1-10ml放大体系表达
3	目标蛋白表达及纯化	通过亲和、离子交换及分子筛等多种层析方法纯化目的蛋白		多条件纯化方案（可选）针对膜蛋白，我们提供不同去垢剂纯化服务，以确保您的膜蛋白适合的最佳缓冲。活性膜蛋白最适合采用该优化方案。
4	其他（可选）服务	收费	酶切去标签服务	灵活的附加服务（可选）提供多种附加服务，客户可根据实验需求灵活选择	3个工作日
4	其他（可选）服务	免费	可提供无菌操作、内毒素去除和冻干等服务（备注：冻干与无菌操作不可同时满足）	灵活的附加服务（可选）提供多种附加服务，客户可根据实验需求灵活选择	2个工作日
5	质控	进行纯度、浓度等检查，并提供QC报告		详细的质控报告为每个项目提供产品说明书及完善的质控报告	3-5工作日
总时间					20-30工作日

案例展示

案例1：无细胞表达系统表达多次跨膜蛋白

以下三个蛋白质分别具有5、6和7个跨膜结构域。由于在体内表达系统中难以表达多次跨膜蛋白质，或者产量非常低，华美生物使用无细胞表达系统来制备这三个蛋白质。为了增加产量，我们尝试了各种表达条件供客户选择。图1、2和3分别展示了这三个蛋白质在不同条件下的小规模表达情况，并选择最佳条件进行大规模表达。

Lane1:反应条件1
Lane2: 反应条件2
Lane3: 反应条件3
Lane4: 反应条件4
Lane5: 反应条件5
Lane6: 反应条件6

案例2：无细胞表达系统表达大分子量高次跨膜蛋白

所展示案例为9次跨膜蛋白，分子量为141.7kDa。基于细胞的表达系统难以表达高次且大分子量跨膜蛋白。华美生物采用大肠无细胞表达系统成功表达，SDS-PAGE检测肉眼可见。

Lane1:反应条件1
Lane2: 反应条件2
Lane3: 反应条件3
Lane4: 反应条件4
Lane5: 反应条件5

案例3：无细胞表达系统显著提高蛋白表达量

这个项目的蛋白质产量很低，华美生物采用无细胞表达系统，通过优化不同的N-末端肽，产量显著提高，如图5所示。

Lane 1: 标签 1
Lane 2: pET-28a(+) control
Lane 3: 标签2
Lane 4: 标签3
Lane 5: 标签4
Lane 6: 标签5
Lane 7: 标签6
Lane 8: 标签7

案例4：无细胞表达系统表达高活性膜蛋白

HTR1B为GPCR系列的膜蛋白，含有7次跨膜域。我们成功表达了该蛋白质并进行了功能活性验证，结果表明该蛋白质具有生物活性。

The Binding Activity of HTR1B (7TM) with GSTK1

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized HTR1B at 5 μg/ml can bind human GSTK1, the EC₅₀ of human GSTK1 protein is 159.40-218.50 ng/ml.

SLC7A11含有12次跨膜域。我们成功表达了该蛋白质并进行了功能活性验证，结果表明该蛋白质具有生物活性。

The Binding Activity of SLC7A11 with anti-SLC7A11 recombinant antibody

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized human SLC7A11 at 2 μg/ml can bind anti-SLC7A11 recombinant antibody, the EC₅₀ is 12.70-16.68ng/ml