酵母表达纯化服务
酵母蛋白表达系统是一种高经济性的真核表达系统,可分泌表达表达也可胞内表达。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力,所表达的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较原核表达的蛋白质更加稳定,特别适用于真核基因表达和功能蛋白的制备。
酵母分泌表达可以将表达的外源蛋白分泌到细胞外基质中,因此更容易获得高纯度蛋白。
酵母表达系统具有的诸多优势使其研究和应用越来越广泛。
系统优势
- 无自产内毒素;
- 产物可翻译后修饰:糖基化、磷酸化、酰酯化等,蛋白具有生物活性的可能性更高;
- 产物可正确折叠和高效分泌;
- 性质较原核表达的蛋白质更加稳定,特别适合于表达和制备具有功能的蛋白:如结核类蛋白、防御素类蛋白、白介素蛋白及细胞因子等。
服务优势
- 无风险定制,不成功不收费;
- 特有的PickRight技术,转化后免筛选直接可获得高表达量菌株,相比传统筛选节省5-10个工作日;
- 高产量:摇瓶培养条件下高达100mg/L;
- 高性价比:价格低至5200元起;
- 货期短:最短35工作日即可交付。
我们承诺
注:该无风险定制蛋白服务仅适用于800个氨基酸以内的蛋白质。如果您需要表达超过800个氨基酸的蛋白质,我们将按步骤收费。
服务内容
步骤 | 服务项目 | 服务说明 | 华美生物特色 | 周期 | |
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1 | 表达载体构建
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密码子优化全基因合成 | 多载体优化 为了提高的表达成功率以及获得更高表达量,除常规N端融合表达蛋白外,我们还提供C端融合标签,在确保纯度的同时使其具有活性可能更高。 |
5-10工作日 | |
PCR扩增产物酶切连接到pPic9k,pPic3.5k,pPiczαA等载体上 | |||||
转化TOP10宿主 | |||||
获得测序正确的重组质粒 | |||||
2 | 转化及菌株鉴定
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重组质粒大量制备 | 高拷贝筛选 通过不同载体特有的筛选标记进行多轮筛选,逐步得到表达量最高的菌株。 |
铜离子胁迫专利 转化后免筛选直接可获得高表达量菌株,时间相比传统筛选减少5-10工作日。 |
10-13工作日 |
线性化重组质粒 | |||||
电击转化至GS115、X33、KM71等宿主 | |||||
PCR鉴定挑选阳性菌株 | |||||
用遗传霉素G418、Zeocion等抗生素进行多拷贝子筛选,获得高拷贝子 | |||||
3 | 小试及放大表达纯化
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小试表达筛选(20-40株) | 7-12工作日/15-25工作日(特色纯化) | ||
定株,优化表达条件 | |||||
放大培养 | |||||
通过亲和、离子交换、疏水及分子筛等多种层析方法纯化目的蛋白 | 多条件纯化策略(可选) 完善的DOE方案,利用AKTA对离子交换、疏水等层析条件进行摸索,锁定最适纯化策略。 |
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4 | 其他(可选)
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通过酶切去除标签或采用无标签载体表达 | 灵活的附加服务(可选) 提供多种附加服务,客户可根据实验需求灵活选择 |
3工作日 | |
提供无菌过滤及内毒素去除服务 | 2工作日 | ||||
5 | 质控
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蛋白浓度、纯度等检查,并提供QC报告 | 详细的质控报告 为每个项目提供产品说明书及完善的质控报告 |
3-5工作日 | |
总时间 | 25-40工作日 |
特色表达体系
● pPic9k-JT质粒+GS115菌株高效表达
载体特色
- 携带有AOX1强启动子,含有alpha分泌因子可高效分泌表达;
- 无缝克隆连接不惧任何内切酶位点;
- 多个线性化位点:SalⅠ,SacⅠ,BglⅡ;
- 原核阶段可进行Amp和Kan双抗性筛选阳性菌株;
- 真核阶段可进行His+和G418筛选高表达菌株;
- 改造过的多克隆位点,克隆不受目的基因中潜在的核酸内切酶位点限制;
- 载体自带his 标签,方便克隆与纯化。
● pPic9k-SUMOSTAR质粒+GS115菌株高效表达
载体特色
- 携带有AOX1强启动子,含有alpha分泌因子可高效分泌表达;
- 含有SUMOSTAR融合蛋白,具有很强促表达能力;
- 无缝克隆连接不惧任何内切酶位点;
- 含有EK酶切位点,酶切可得到无标签蛋白;
- 多个线性化位点:SalⅠ,SacⅠ;
- 原核阶段可进行Amp和Kan双抗性筛选阳性菌株;
- 真核阶段可进行His+和G418筛选高表达菌株;
- 改造过的多克隆位点,克隆不受目的基因中潜在的核酸内切酶位点限制;
- 载体自带his 标签,方便克隆与纯化。
案例展示
案例1: 酵母表达系统表达高纯度蛋白
难点:酵母胞内表达,破菌后纯化,可以看出裂解液中杂蛋白非常多(泳道1),目的蛋白非常不明显,经过酵母系统特有的层析系统一次纯化,用SDS-PAGE检测看不到杂带,纯度达到95%以上(泳道6-7)。
泳道1:裂解液
泳道2:上样穿透液
泳道3:Marker
泳道4-7:不同梯度洗脱下来的目的蛋白
泳道1:裂解液
泳道2:上样穿透液
泳道3:Marker
泳道4-7:不同梯度洗脱下来的目的蛋白
特点:酵母分泌表达,蛋白表达后直接分泌到培养基中,基本无杂蛋白,本身纯度就高达90%以上,通过纯化主要是去除色素及培养基中其他残留物质,只留下在适宜缓冲中的目的蛋白。
泳道1:发酵液上清
泳道2:Marker
泳道3:上样穿透液
泳道4:洗脱下来的目的蛋白
案例2: 酵母表达系统表达大分子量蛋白
难点:700氨基酸以上,81kDa,为了得到较高纯度,选择分泌载体进行表达,成功表达并分泌出来。
泳道1:发酵液上清
泳道2:上样穿透液
泳道3:洗脱下来的目的蛋白
泳道4:Marker
案例3: 酵母表达系统表达小分子蛋白
难点:46氨基酸,7kDa,分子量非常小,相对来说不太容易检测及浓缩,从SDS-PAGE检测图来看表达、纯化、收集都非常成功。
泳道1:发酵液上清
泳道2:洗脱下来的目的蛋白
泳道3:Marker
难点:36氨基酸以上,4kDa,分子量非常小,而且这个客户要求切除标签,在分子量本身就很小的情况下切除标签是非常有难度的,但我们经过一系列处理后成功将标签切除,且WB用标签抗体检测目的蛋白中不含蛋白标签,最终得到了高纯度、小分子量的无标签蛋白。
案例4:酵母表达系统表达N-型糖基化修饰蛋白
特点:接近天然蛋白的修饰,尤其是糖基化修饰在酵母表达系统特别明显,用SDS-PAGE检测呈弥散状条带且偏大,经过去N-型糖基化修饰的Endo H酶消化,带型变实且大小与理论值吻合。
泳道1:纯化后的目的蛋白(N-型糖基化修饰)
泳道2:经Endo H去糖基化修饰后的蛋白
泳道3:Marker
联系信息
电话:027-87002556
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